尊龙凯时(中国区)人生就是搏提供的细胞培养指导包括以下内容，确保您能够成功进行细胞传代、冻存及复苏，保持细胞的生长活力。

培养条件

气相条件为95%空气和5%二氧化碳，培养温度设定在37℃。

细胞传代方法

首次传代时建议以1:2的比例进行传代。传代后，每2天更换培养液。建议在购买时选择与细胞培养基一起购买，以获取更优惠的价格。

收到细胞后，应尽快处理，培养至稳定状态，然后加满完全培养液并封闭瓶口，以确保细胞在运输过程中的安全。

打开细胞瓶时，先用75%酒精喷洒整个瓶身进行消毒，然后将细胞瓶放入超净台内进行无菌操作。接下来，将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便细胞恢复稳定后再进行处理。显微镜下观察细胞的生长情况，并拍照保存（建议拍摄倍数为40x、100x、200x各一张），前三天的照片为重要的售后依据，若未提供照片则默认为细胞状态良好。

细胞培养步骤

细胞传代

若细胞未超过80%汇合度，将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml继续培养于37℃、5% CO2的孵箱内；若细胞密度超过80%，可进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用无钙镁PBS洗涤细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶，置于37℃培养箱内消化1-2分钟，观察细胞的消化状态。若细胞大部分变圆并脱落，迅速将其取出，轻拍培养瓶后加入超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出悬液，转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清液后加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分配至两个T25瓶中，补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，并放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

悬浮细胞的传代步骤如下：

1. 采用半换液法，将培养瓶竖放在培养箱中静置约1小时，轻轻吸去约3ml培养基后，补充3ml完全培养基。如培养基变色缓慢，可直接加入约500ul FBS。传代时可直接补充5ml培养基，并分为两个培养瓶培养，一般此法使用3次后，可进行离心传代以去除死细胞。
2. 采用离心换液法时，将细胞悬液收集至离心管中，以1000rpm离心5分钟，弃去上清后补加1-2ml培养液并重悬。将细胞悬液按1:2比例分至新T25瓶中，并添加6-8ml新配制的完全培养基以维持细胞的生长活力，后续传代根据细胞状态按1:2至1:5的比例进行。

细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞回缩变圆后，添加5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，将细胞沉淀加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，如后期需转入液氮罐中，需在-80℃冰箱中存放超过24小时。

细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，随后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，将沉淀用5ml完全培养基重悬，并接种至T25培养瓶中，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。
4. 次日更换为新鲜的完全培养基，继续培养。

注意事项

有些细胞可能在运输过程中不易粘附，导致细胞脱落，这属于正常现象。如细胞脱落较多，可将培养瓶中的所有培养液收集至离心管中，1000rpm离心5分钟，并收集上清进行过渡培养（以便后期对比）。随后，加入1-2ml胰酶轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后，加入5ml完全培养基以终止反应。经过再次离心处理后，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬，并按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后恢复至37℃、5% CO2的细胞培养环境中。

尊龙凯时(中国区)人生就是搏，在细胞培养的过程中为您提供全面的支持与指导，确保您的每一步操作安全高效。